Метод ПЦР (полимеразной цепной реакции), или охота на чуждую ДНК

ПЦР. Расшифровка этой аббревиатуры из трёх букв – это годы неустанных исканий и исследований Нобелевского лауреата 1993 года Кэри Муллиса, подарившего миру открытие, сделанное в области молекулярной биологии.Что же за метод анализа предложил он человечеству и чем тот стал так полезен медицине?

ДНК и РНК: сердце всего живого

Исследования показали: содержащиеся в ядре клетки нуклеиновые кислоты – ДНК и РНК – это не только хранилища генетической информации. Это ещё и матрицы – программы, способные копировать самих себя в сколь угодно больших количествах и объёмах. Благодаря такому свойству живые организмы способны размножаться.

Высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики это Полимеразная цепная реакция(ПЦР)

Чем мельче размеры живой субстанции, тем быстрее идёт нарастание общей массы. Наибольшей же стремительностью размножения обладают вирусы и микробы, среди которых – возбудители болезней человека.

При возникновении заболевания необходимо как можно быстрее ответить на два главных вопроса:

1. Есть ли в организме именно тот возбудитель, который вызывает наиболее сильное подозрение развитием именно данных клинических проявлений?
2. Если это – не он, то какое другое болезнетворное начало стало причиной явления?

Общепринято считать: для установления вида возбудителя болезни необходима идентификация всех звеньев бесконечно длинной цепи являющейся его основой ДНК, что требует затраты большого количества времени.

Сейчас этот вопрос перестал быть актуальным – необходимости такой громоздкой и медленной методики отныне не существует. Потому что появился и работает метод ПЦР. Он основан на том, что ДНК копирует только саму себя.

Несмотря на то, что число нуклеотидов, составляющих генетическую цепь любой степени сложности, ограничено четырьмя, а вариантов их сочетаний – множество, для каждой единицы живой материи это сочетание строго индивидуально.

Поэтому ДНК холерного вибриона отличается от РНК вируса гриппа, а комбинация нуклеотидов ДНК туберкулёзной палочки совсем не похожа на присущую вирусу бешенства. Это и позволяет идентифицировать одну обнаруженную генетическую матрицу от другой, к тому же – быстро.

Метод «ключа в замке»

На помощь здесь приходит метод ПЦР – анализ ДНК возбудителя. Он похож на процедуру открытия замка методом подбора ключей. Поскольку для каждого замка ключ – свой, имея ключ, можно легко выяснить конструкцию замка.

Точно так же обладание эталонным фрагментом ДНК – «ключом», совпадающим с уникальной конструкцией «замком» в ДНК (РНК) микроорганизма – позволяет выяснить «конструкцию» обладателя данного типа ДНК.

Но ПЦР не только обнаруживает «ключевой» участок нуклеотидной цепи – она запускает копирование данного фрагмента нуклеиновой кислоты, подобное по принципу цепной реакции ядерного распада. Изобилие полученного таким способом генетического материала обеспечивает 100% успеха при установлении вида исследуемого возбудителя.

РНК — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки) , которые содержатся в клетках всех живых организмов

Имеющегося арсенала подобных «ключей» уже достаточно для идентификации микроорганизмов, являющихся причиной самых разнообразных болезней и состояний организма.

ПЦР подходит не только для установления сути микробов-возбудителей – она пригодна для исследования любого живого материала: среза или обрывка ткани, фрагмента отдельной клетки, клеточного состава биологической жидкости или содержимого кишечника в виде кала.

Генетический детектор всего живого

Учитывая единый принцип строения любой живой субстанции, исследование с применением ПЦР позволяет осуществить:

• проведение генетической экспертизы (выявление наследственных болезней и факта отцовства);
• клонирование организма на основе считывания его генома;
• создание ранее неосуществимых генных комбинаций.

Но наиболее востребованной является методика ПЦР для медицины, когда речь заходит о необходимости уничтожения посетившей тело человека чужой жизни.

Преимущества, даваемые методом

Уникальность разработанной методики – крайне высокая чувствительность: она указывает на наличие возбудителя, даже когда представительство его в материале (например, в кале) ограничено всего несколькими молекулами его ДНК.

К достоинствам анализа с помощью метода полимеразной цепной реакции, помимо универсальности (способности выявлять любые типы РНК и ДНК) и высокой специфичности (100% выявления как одного конкретного возбудителя, так и идентификация сразу нескольких различных возбудителей в одном и том же исследуемом материале: рвотных массах, кале, ликворе и прочем), следует отнести:

• быстроту (реакция производится за несколько часов, а всё время анализа, включая расшифровку, занимает не более одного дня);
• возможность идентификации болезнетворного начала даже в период инкубации, не дожидаясь реакции организма на начало его жизнедеятельности.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — распространенный метод ДНК-исследования

Такое положительное качество данного метода анализа, как возможность обнаружения возбудителей, растущих сверхдолгое время, относится к заметным преимуществам по сравнению с другими методами диагностики. Сюда же можно причислить и возможность выявления болезнетворных агентов:

• культивируемых трудно;
• не культивируемых вообще;
• существующих в скрытной форме.

А также доступность для диагностики случаев внутриклеточного паразитирования.

Методика в действии (некоторые области применения)

Среди наиболее востребованных областей применения анализа методом ПЦР особо следует выделить сферу:

• урогенитальных (гинекологических и урологических);
• бронхо-лёгочных;
• желудочно-кишечных инфекций.

Гастроэнтерология использует методику для проведения изучения состояния развития патологической микрофлоры желудка (хеликобактериоз) и кишечника, для диагностики кала на яйца гельминтов, на содержание в нём:

• аденовирусов;
• энтеровирусов;
• ротавирусов;
• иерсинии псевдотуберкулёза;
• патогенных штаммов кишечной палочки.

Анализ кала методом полимеразной цепной реакции позволяет также оценить уровень засеянности патогенной микрофлорой гепато-панкреатической системы, желчевыводящих протоков, состояние которых чувствительно сказывается на функциях этих важнейших пищеварительных желёз, диагностировать паразитоносительство (лямблиоз и иные случаи заражения простейшими, которые иные методики анализа кала диагностировать не способны).

ПЦР занимает почетное место среди других клинических лабораторных исследований

Преимущества ПЦР анализа:

• непосредственное определение наличия болезнетворных начал по фрагментам их ДНК;
• высокая специфичность метода;
• его высокая чувствительность (способность выявить даже единственный вирус или бактериальную клетку);
• высокая скорость (не более 4-5 часов) получения результата.

Возможность выявления степени распространённости в организме возбудителей СПИДа, гепатитов, хламидиоза, сифилиса также позволяет высоко оценить новую перспективную методику анализа кала, предлагаемую лабораторной службой.

Трактовка полученных данных

Оценка результата ПЦР-исследования (его расшифровка) должна производиться врачом, лечащим конкретного больного, ибо получение положительного ответа ещё не означает факта заболевания – погибший при лечении микроорганизм ещё долго будет сигнализировать о своём наличии в теле человека.

Отрицательно же выглядящий результат при выраженной клинике заболевания свидетельствует о случае неправильного забора материала для проведения реакции.

Такое состояние дел невозможно представить в случае, когда и забор образца материала, и его обработку, и расшифровку проводит квалифицированный врач, строго следующий инструкции по применению методики.